2 × смесь Pfu PCR

Шаблон A-1

■ Шаблон содержит белковые примеси или ингибиторы Taq и т. Д. - Очистите матрицу ДНК, удалите примеси белка или извлеките матричную ДНК с помощью наборов для очистки.

■ Денатурация шаблона не завершена —— Увеличьте температуру денатурации и увеличьте время денатурации.

■ Ухудшение качества шаблона - повторно подготовьте шаблон.

Праймер А-2

■ Низкое качество праймеров - повторно синтезируйте праймер.

■ Разрушение грунтовки —— Разбавьте праймеры с высокой концентрацией в небольшом объеме для консервации. Избегайте многократного замораживания и оттаивания или длительного криоконсервации при 4 ° C.

■ Неправильный дизайн праймеров (например, длина праймера недостаточная, димер образовался между праймерами и т. Д.) -Изменить дизайн праймеров (избегать образования димера праймера и вторичной структуры)

А-3 мг²⁺концентрация

■ Mg²⁺ концентрация слишком низкая —— Правильно увеличьте Mg²⁺ концентрация: оптимизировать Mg²⁺ концентрация посредством серии реакций от 1 мМ до 3 мМ с интервалом 0,5 мМ для определения оптимального Mg²⁺ концентрация для каждой матрицы и праймера.

A-4 Температура отжига

■ Высокая температура отжига влияет на связывание праймера и шаблона. —— Уменьшите температуру отжига и оптимизируйте условия с градиентом 2 ° C.

A-5 Время продления

■ Короткое время продления —— Увеличьте время продления.

Явления: отрицательные образцы также показывают полосы целевой последовательности.

А-1 Загрязнение ПЦР

■ Перекрестное загрязнение целевой последовательности или продуктов амплификации - осторожно, не пипетируйте образец, содержащий целевую последовательность в отрицательном образце, и не проливайте их из центрифужной пробирки. Реагенты или оборудование следует автоклавировать для удаления существующих нуклеиновых кислот, а наличие загрязнения следует определять с помощью экспериментов с отрицательным контролем.

■ Загрязнение реагентов —— Смажьте реагенты и храните при низкой температуре.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ концентрация слишком низкая —— Правильно увеличьте Mg²⁺ концентрация: оптимизировать Mg²⁺ концентрация посредством серии реакций от 1 мМ до 3 мМ с интервалом 0,5 мМ для определения оптимального Mg²⁺ концентрация для каждой матрицы и праймера.

■ Неправильный дизайн праймера, и целевая последовательность гомологична нецелевой последовательности. —— Редизайн грунтовок.

Явления: Полосы ПЦР-амплификации не соответствуют ожидаемому размеру, большие или маленькие, или иногда встречаются как специфические полосы амплификации, так и неспецифические полосы амплификации.

Праймер А-1

■ Низкая специфичность праймера.

—— Редизайн грунтовки.

■ Слишком высокая концентрация праймера —— Надлежащим образом увеличьте температуру денатурации и увеличьте время денатурации.

А-2 мг²⁺ концентрация

■ Mg²⁺ концентрация слишком высока —— Правильно уменьшите концентрацию Mg2 +: Оптимизируйте содержание Mg²⁺ концентрация посредством серии реакций от 1 мМ до 3 мМ с интервалом 0,5 мМ для определения оптимального Mg²⁺ концентрация для каждой матрицы и праймера.

A-3 Термостабильная полимераза

■ Избыточное количество фермента —— Уменьшите количество фермента соответствующим образом с интервалом 0,5 Ед.

A-4 Температура отжига

■ Температура отжига слишком низкая —— Увеличьте температуру отжига или используйте метод двухэтапного отжига.

Циклы ПЦР A-5

■ Слишком много циклов ПЦР —— Уменьшите количество циклов ПЦР.

Праймер А-1—— Низкая специфичность —— Измените дизайн праймера, измените положение и длину праймера, чтобы повысить его специфичность; или выполнить вложенную ПЦР.

ДНК-матрица A-2

—— Матрица не чистая —— Очистите матрицу или извлеките ДНК с помощью наборов для очистки.

А-3 мг²⁺ концентрация

——Mg²⁺ концентрация слишком высока —— Правильно уменьшите Mg²⁺ концентрация: оптимизировать Mg²⁺ концентрация посредством серии реакций от 1 мМ до 3 мМ с интервалом 0,5 мМ для определения оптимального Mg²⁺ концентрация для каждой матрицы и праймера.

A-4 dNTP

—— Слишком высокая концентрация dNTP —— Уменьшите концентрацию dNTP соответствующим образом

A-5 Температура отжига

—— Слишком низкая температура отжига —— Увеличьте температуру отжига соответствующим образом

Циклы A-6

—— Слишком много циклов —— Оптимизируйте номер цикла

Первый шаг - выбрать подходящую полимеразу. Обычная полимераза Taq не может быть проверена из-за отсутствия 3'-5'-экзонуклеазной активности, а несоответствие значительно снизит эффективность удлинения фрагментов. Следовательно, обычная полимераза Taq не может эффективно амплифицировать целевые фрагменты размером более 5 т.п.н. Полимераза Taq со специальной модификацией или другая высокоточная полимераза должна быть выбрана для повышения эффективности удлинения и удовлетворения потребностей амплификации длинных фрагментов. Кроме того, амплификация длинных фрагментов также требует соответствующей корректировки конструкции праймера, времени денатурации, времени удлинения, pH буфера и т. Д. Обычно праймеры с 18-24 п.н. могут привести к лучшему выходу. Чтобы предотвратить повреждение шаблона, время денатурации при 94 ° C следует сократить до 30 секунд или меньше за цикл, а время повышения температуры до 94 ° C перед амплификацией должно быть менее 1 мин. Более того, установка температуры удлинения около 68 ° C и проектирование времени удлинения в соответствии со скоростью 1 т.п.н. / мин может обеспечить эффективную амплификацию длинных фрагментов.

Частоту ошибок при амплификации ПЦР можно снизить, используя различные ДНК-полимеразы с высокой точностью. Среди всех обнаруженных к настоящему времени ДНК-полимераз Taq фермент Pfu имеет самый низкий уровень ошибок и самую высокую точность (см. Прилагаемую таблицу). Помимо выбора ферментов, исследователи могут дополнительно снизить скорость мутаций ПЦР за счет оптимизации условий реакции, включая оптимизацию состава буфера, концентрацию термостабильной полимеразы и оптимизацию количества циклов ПЦР.