Комплект FastKing RT (с gDNase)

РНК A-1 расщепляется

——Очистите РНК высокого качества от загрязнения. Материал, из которого извлекается РНК, должен быть как можно более свежим, чтобы предотвратить деградацию РНК. Перед реакцией RT проанализируйте целостность РНК на денатурированном геле. После выделения РНК ее следует хранить в 100% формамиде. Если используется ингибитор РНКазы, температура нагревания должна быть <45 ° C, а pH должен быть меньше 8,0, в противном случае ингибитор высвободит всю связанную РНКазу. Более того, ингибитор РНКазы следует добавлять в растворы, содержащие ≥ 0,8 мМ DTT.

РНК А-2 содержит ингибиторы реакций обратной транскрипции.

—— Ингибиторы обратной транскрипции включают SDS, EDTA, глицерин, пирофосфат натрия, спермидин, формамид, соль гуанидина и т. Д. Смешайте контрольную РНК с образцом и сравните выход с реакцией контрольной РНК, чтобы проверить наличие ингибитора. Промойте осаждение РНК 70% (об. / Об.) Этанолом для удаления ингибиторов.

A-3 Недостаточный отжиг праймеров, используемых для синтеза первой цепи кДНК

—— Определите, что температура отжига подходит для праймеров, использованных в эксперименте. Для случайных гексамеров рекомендуется поддерживать температуру 25 ° C в течение 10 минут до достижения температуры реакции. Для ген-специфичных праймеров (GSP) попробуйте другой GSP или переключитесь на олиго (dT) или случайный гексамер.

A-4 Небольшое количество стартовой РНК

—— Увеличьте количество РНК. Для образцов РНК менее 50 нг, от 0,1 мкг до 0,5 мкг ацетил-БСА можно использовать в синтезе первой цепи кДНК.

A-5 Целевая последовательность не экспрессируется в анализируемых тканях.

—— Попробуйте другие ткани.

Реакция ПЦР A-6 не удалась

—— Для двухэтапной ОТ-ПЦР матрица кДНК на стадии ПЦР не может превышать 1/5 реакционного объема.

A-1 Неспецифический отжиг праймеров и шаблонов

——3'-конец праймеров не должен содержать 2-3 dG или dC. Используйте ген-специфические праймеры в синтезе первой цепи вместо случайных праймеров или олиго (dT). Используйте более высокую температуру отжига в первые несколько циклов, а затем более низкую температуру отжига. Используйте ДНК-полимеразу Taq с горячим стартом для ПЦР, чтобы улучшить специфичность реакции.

A-2 Неудачный дизайн ген-специфических праймеров

—— Следуйте тем же принципам для дизайна праймеров для амплификации.

РНК А-3, загрязненная геномной ДНК

—— Обработка РНК ДНКазой I класса ПЦР. Для обнаружения загрязнения ДНК настройте контрольную реакцию без обратной транскрипции.

A-4 Образование димера праймера

—— Разработайте праймеры без комплементарных последовательностей на 3'-конце.

A-5 Слишком высокое содержание Mg²⁺ концентрация

——Оптимизировать Mg²⁺ концентрация для каждой комбинации матрицы и праймера

A-6, загрязненный чужеродной ДНК

—— Используйте устойчивые к аэрозолям наконечники и ферменты UDG.

A-1 Слишком высокое содержание продукта первой нити.

—— Уменьшите количество продукта первой цепи на стандартной стадии реакции ПЦР.

A-2 Слишком большое количество праймера в реакции ПЦР

—— Уменьшить ввод праймера.

A-3 Слишком много циклов

—— Оптимизируйте условия реакции ПЦР и уменьшите количество циклов ПЦР.

A-4 Слишком низкая температура отжига

—— Увеличьте температуру отжига, чтобы предотвратить неспецифическое инициирование и удлинение.

A-5 Неспецифическая амплификация олигонуклеотидных фрагментов, образующихся при расщеплении ДНК ДНКазой - извлечение высококачественной РНК для предотвращения загрязнения ДНК.

ОТ-ПЦР предназначена для обратной транскрипции РНК в кДНК, а затем использования обратно транскрибированной кДНК в качестве матрицы для реакции ПЦР для амплификации целевого фрагмента. Выберите случайные праймеры, Oligo dT и специфичные для генов праймеры в соответствии с конкретными условиями эксперимента. Все вышеперечисленные праймеры можно использовать для коротких мРНК эукариотических клеток без шпилечной структуры.

Случайный праймер: подходит для длинной РНК со структурой шпильки, а также для всех видов РНК, таких как рРНК, мРНК, тРНК и т. Д. Они в основном используются для реакции RT-PCR одной матрицы.

Oligo dT: подходит для РНК с хвостом PolyA (прокариотическая РНК, эукариотическая рРНК Oligo dT и тРНК не имеют хвостов PolyA). Поскольку Oligo dT связан с хвостом полиА, качество образцов РНК должно быть высоким, и даже небольшая степень деградации значительно снизит объем синтеза полноразмерной кДНК.

Ген-специфический праймер: комплементарен матричной последовательности, подходит для ситуаций, когда целевая последовательность известна.

Есть два пути:

1. Метод внутреннего эталона. Теоретически кДНК - это фрагменты ДНК разной длины, поэтому результат электрофореза - мазок. Если содержание РНК низкое, никакой продукт не будет отображаться при электрофорезе, но это не означает, что никакой продукт не будет амплифицирован с помощью ПЦР. Как правило, для обнаружения кДНК можно использовать внутреннюю ссылку. Если внутренняя ссылка дает результаты, качество кДНК может быть в основном гарантировано (в некоторых случаях, если целевой генный фрагмент слишком длинный, могут быть исключения).

2. Если с помощью этой матрицы амплифицирован известный ген, его можно проверить с помощью праймеров этого гена. Амплификация внутреннего эталона не обязательно означает отсутствие проблем с кДНК. Поскольку внутренний эталон имеет большое количество кДНК, его легко амплифицировать. Если кДНК частично разлагается по разным причинам, то с точки зрения вероятности это сильно повлияет на результаты ПЦР для генов-мишеней с низким содержанием. Хотя внутреннего эталона все еще много, усиление, вероятно, не пострадает.

Частичная деградация РНК. Обнаружить целостность и очистить РНК

Содержание РНК у разных видов может быть разным, но в целом экстрагированная общая РНК должна содержать две четкие полосы 28S и 18S при гель-электрофорезе, а яркость первой полосы должна быть в два раза выше, чем яркость второй. Полоса 5S указывает на то, что РНК деградировала, и ее яркость пропорциональна степени деградации. Успешная амплификация внутреннего эталона не означает, что с РНК нет проблем, поскольку внутренний эталон находится в большом количестве, РНК можно амплифицировать, если деградация не является серьезной. OD₂₆₀/ OD₂₈₀соотношение чистой РНК, измеренное спектрофотометром, должно быть от 1,9 до 2,1. Небольшое количество белковой примеси в РНК снизит соотношение. Пока значение не слишком низкое, RT не изменится. Что наиболее важно для ОТ, так это целостность РНК.

Расширение внутреннего эталонного гена может указывать только на успешное выполнение RT, но не обязательно связано с качеством цепи кДНК. Поскольку внутренние эталонные фрагменты обычно имеют небольшой размер и высокую экспрессию, их легче добиться при обратной транскрипции. Однако размер и экспрессия целевого гена варьируются от гена к гену. О качестве кДНК нельзя судить только по внутренним ссылкам, особенно для целевых фрагментов длиной более 2 т.п.н.

Некоторые образцы имеют сложную вторичную структуру, содержат большое количество GC или имеют низкое содержание. В этих случаях следует выбрать подходящую обратную транскриптазу в соответствии с размером целевого фрагмента и образца. Для матриц РНК с высоким содержанием GC и сложной вторичной структурой трудно открыть вторичную структуру при низкой температуре или с помощью обычной обратной транскриптазы. Для этих матриц может быть выбрана обратная транскриптаза Quant, поскольку ее эффективность обратной транскрипции, очевидно, лучше, чем у обратной транскриптазы серии M-MLV, которая может эффективно осуществлять обратную транскрипцию различных матриц РНК и максимально транскрибировать РНК в первую цепь кДНК. При использовании общего набора для обратной транскриптазы система из 20 мкл может эффективно осуществлять обратную транскрипцию только 1 мкг общей РНК. Обратите внимание на максимальную вместимость набора RT. Если шаблон добавлен в избытке, обратная транскрипция будет способствовать РНК с высоким содержанием. Поэтому лучше не превышать максимальную мощность системы.

A-1 Определите, сильно ли деградирована РНК и успешна ли ЛТ

В общем, причина неудачной амплификации внутреннего эталона часто вызвана серьезной деградацией РНК. Другая возможная причина - сбой обратной транскрипции. Внутренняя ссылка не может использоваться в качестве стандарта для оценки качества одноцепочечной кДНК, но ее можно использовать в качестве стандарта для оценки успешности обратной транскрипции, если нет проблем с качеством РНК. Самым важным в процессе обратной транскрипции является поддержание постоянной температуры и постоянной реакционной системы для повышения эффективности реакции.

A-2 Определите, являются ли праймеры для амплификации внутренних эталонных генов надежными и есть ли какие-либо проблемы с реагентами, используемыми в ПЦР.

Для относительной количественной оценки РНК должна быть определена количественно перед обратной транскрипцией, что также требуется во многих наборах для обратной транскрипции, например, количественное определение входящей РНК как 1 мкг. Поскольку кДНК с обратной транскрипцией представляет собой смешанный раствор, включающий РНК, олиго-dT, фермент, dNTP и даже небольшой остаток ДНК, возникнет отклонение, поэтому невозможно точно количественно определить кДНК. Следовательно, количественная оценка РНК необходима. Учитывая, что эффективность обратной транскрипции одинакова для разных образцов, количество полученной кДНК должно быть одинаковым, а количественный анализ может показать сравнение уровней экспрессии разных генов в одном и том же количестве общей РНК. При проведении количественной ПЦР с относительной флуоресценцией количественная кДНК может не потребоваться после обратной транскрипции, поскольку внутренний эталонный ген может действовать как эталон.

В основном это связано с генами, и обратная транскрипция длинного фрагмента невозможна для большинства генов. Во-первых, эффективность обратной транскрипции намного ниже, чем у ПЦР. Во-вторых, богатая GC область и вторичная структура многих генов ограничивают как обратную транскрипцию, так и ПЦР. Наконец, трудно гарантировать точность и эффективность ПЦР одновременно. В процессе обратной транскрипции никто не может гарантировать получение длинного фрагмента для генов с низкой копией, особенно с использованием oligo dT. Что касается 5 'UTR с большим количеством GC, это еще сложнее. Следовательно, по-прежнему является разумным методом обратного транскрипта с помощью случайных праймеров, поиска естественных сайтов расщепления в целевом фрагменте, амплификации по сегментам, а затем выполнения рестрикционного переваривания и лигирования. В общем, сложно напрямую амплифицировать фрагменты размером более 2 т.п.н., но не всегда невозможно получить: 1. Прежде всего, гарантировать целостность РНК / мРНК, предпочтение отдается экстракции ТРИЗОЛ. 2. Можно напрямую использовать набор M-MLV RT-PCR. Увеличьте время отжига и увеличьте количество циклов в процессе амплификации должным образом. В качестве альтернативы можно применить вложенную ПЦР или провести сначала одну или две реакции с соответствующим образом увеличенным временем денатурации и удлинения перед нормальной амплификацией ПЦР, что может помочь удлинить фрагменты. Обратите внимание на верность полимеразы. 3. Long Taq можно использовать в ПЦР для получения идеальных результатов. 4. Для экспрессии белка следует применять высокоточная полимераза.

TIANGEN предлагает два типа обратной транскриптазы: Quant / King RTase и TIANScript M-MLV. Основное различие между ними - количество вводимых шаблонов. Quant - уникальная обратная транскриптаза, которая отличается от обычно используемой M-MLV, полученной из вируса мышиного лейкоза Молони. Quant - это новая высокоэффективная обратная транскриптаза, рекомбинантно экспрессируемая с помощью Escherichia coli. Quant подходит для амплификации 50 нг-2 мкг РНК с высокой активностью обратной транскрипции и высоким выходом. По сравнению с обычным MMLV или AMV, самой большой характеристикой Quant является то, что он имеет очень сильное сродство с матрицами РНК и может реверсировать сложные шаблоны транскрипции без высокотемпературной денатурации. Для шаблонов с более высоким содержанием GC обратная эффективность выше. Однако эта обратная транскриптаза обладает активностью РНКазы H, которая может влиять на длину продукта кДНК (подходит для матриц размером <4,5 т.п.н.). Для обычной обратной транскрипции рекомендуется обратная транскриптаза TIANScript MMLV. Эта RTase представляет собой модифицированный фермент с очень слабой активностью РНКазы H, который подходит для синтеза длинной (> 5 т.п.н.) кДНК.

Одностадийная обратная транскрипция и ПЦР-амплификация выполняются в одной пробирке без открытия крышки пробирки между синтезом кДНК и амплификацией, что помогает снизить загрязнение. Поскольку все полученные образцы кДНК используются для амплификации, чувствительность выше и составляет минимум 0,01 пг общей РНК. Для успешного одностадийного RTPCR обычно используются специфичные для генов праймеры для инициации синтеза кДНК. Двухэтапный метод, а именно обратная транскрипция и ПЦР-амплификация, проводится в два этапа. Сначала проводят обратную транскрипцию с матрицы РНК для получения кДНК, и полученную кДНК подвергают одной или нескольким различным реакциям ПЦР. Двухэтапный метод может использовать олиго (dT) или случайные праймеры для управления синтезом первой цепи кДНК и может осуществлять обратную транскрипцию всей информации мРНК из определенного образца.